Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В ходе выполнения проекта для последующей селекции устойчивости к антибиотикам, действующим на клеточную стенку, были отобраны и охарактеризованы изоляты S. aureus, CoNS и S. pneumoniae. Для селекции устойчивости S. aureus к гликопептидам и даптомицину были отобраны 3 изолята с МПК ванкомицина 2 мкг/мл и принадлежащие к генетическим линиям ST8 и ST239, и три изолята с МПК = < 1 мкг/мл тех же линий. К настоящему времени для изолята с МПК ванкомицина = 2 мкг/мл (SA0077, выделен в 2013), а также изолятов с МПК ванкомицина = < 1 мкг/мл (SA00518, выделен в 1998; SA00519, выделен в 2005; SA00520, выделен в 1998 и SA00521, выделен в 1998) получены данные о нуклеотидных последовательностях 24 функциональных генов биосинтеза пептидогликана (glmU, SACOL2161, murA, murAB, murB, murC, murI, murD, ddl, murF, mraY, murG, glnA, pbp4, SACOL1932, pbp1, pbp3, mecA, pbp2, SACOL1779, murE, femX, femA, femB) и 14 - регуляторных (sigB, rpoB, rpoC, vraS, vraR, graR, graS, vraF, vraG, mprF, walK, walR, yvqF, clpP). Установлено, что для части генов (murA, murB, murF, pbp2, pbp4, femX, rpoB, vraG, mprF) характерна высокая частота мутаций. Напротив, гены ddl, murE, walR, clpP остаются относительно интактными. По результатам сравнительного геномного анализа изолятов, циркулирующие на территории РФ в настоящее время, и выделенных в различные временные периоды в различных географических регионах можно сделать вывод, что изоляты из России находятся на промежуточном уровне накопления мутаций в генах биосинтеза пептидогликана. Так у референсного изолята COL, выделенного до начала массового применения ванкомицина, мутации в генах биосинтеза пептидогликана отсутствовали, а у изолятов устойчивого фенотипа (Mu3 и Mu50) количество мутаций было существенно больше, чем у изолятов из РФ. Среди CoNS, устойчивых к оксациллину выявлено значительное разнообразие SCCmec кассет: обнаружены II, IV, IVa, V, VII и VIII типы, а также подтипы CIa, CIb, CIc и СI. Выявлены и другие типы кассет, содержащие комплексы mec классов A, C1 и С2 в сочетании с различными генами рекомбиназ. У изолятов S. epidermidis преобладали кассеты, несущие комплекс mecB, а у изолятов S. Haemolyticus присутствовали кассеты, несущие комплекс mecклассовC1 и C2. Из 9 изолятов S. hominis - 5 несли новый тип кассет: комплекс mec класса A в сочетании с комплексом генов рекомбиназ ссr1. Не удалось идентифицировать SCCmec у представителей S. capitis и S. pasteuri. У представителей этих видов были выявлены либо комплексmec (S. pasteuri - 1 изолят), либо комплексы рекомбиназ S. capitis (2 изолята). Выявленные у CoNS варианты SCCmec могут служить источником для формирования новых генетических линий метициллинрезистентных CoNS и MRSA. Проведенный молекулярный анализ (MLST, серотипирование), а также фенотипическая оценка антибиотикочувствительности клинических изолятов S.pneumoniae, показал, что эта группа микроорганизмов имеет панмиктичный характер структуры популяции. Результаты MLST типирования 65 изолятов загружены в международную базу данных http://pubmlst.org/spneumoniae. Было выявлено 9 доминирующих серотипов и серогрупп, которые принадлежат более чем к 35 генетическим линиям. При этом 30% изолятов относятся к эпидемической группе (СС320), широко распространенной в мире и в нашей стране. В пределах указанного клонального комплекса были выявлены следующие клоны (сиквенс-тип - серотип) – ST320 – 19F/19A, ST239 – 19F/23F, ST505 – 19A/6, ST315 - 6, ST271 – 19A, ST1464 – 19F. Изоляты этой группы проявляют высокую частоту устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Для экспериментов по селекции резистентности были выбраны шесть изолятов S.pneumoniae, принадлежащих к CC320, как устойчивых к бета-лактамам, так и чувствительных(штаммы 78, 558, 375, 3733, 349, 2133, 133 и pgm2). Оптимизирован и сформулирован модифицированный протокол выделения тотальной РНК из клеток Staphylococcus spp. с использованием механического лизиса в криомельнице и тризольного способа экстракции, очистки. Особенность выделения нуклеиновых кислот у грамположительных бактерий заключается в наличие толстой клеточной стенки, сложно подвергаемой лизису стандартными способами. Также с целью изучения пула мРНК для оценки экспрессии генов в присутствие специфических агентов (антибиотиков) крайне важно провести мгновенный лизис клеток во избежание разрушения мРНК, поскольку время полужизни молекулы измеряется минутами. В настоящем исследовании нам удалось добиться быстрого лизиса клеток с максимальным выходом качественной фракции РНК без использования ферментов. Так, при использовании криомельницы FreezerMill 6870 (SPEX Sampleprep, США) с этапом дробления – гомогенизации в жидком азоте с последующим тризольным способом экстракции/очистки, обработкой ДНКазой I, были получены следующие характеристики тотальной РНК. Суммарный выход составил 9±4 мкг (концентрация 150±25 нг/мкл), соотношение 260/280 было не менее 1,85. При проведении электрофореза хорошо визуализировались фрагменты, соответствующие длинам участков 16S, 23S, и 5S рРНК. После проведения реакции обратной транскрипции, детектировались длинноцепочечные фрагменты, соответствующие целевым фрагментам мРНК. Таким образом, оптимизированный протокол может быть использован в приложениях выделения тотальной РНК из грамположительных бактерий для последующей оценки экспрессии генов, транскриптомного анализа.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Работы, выполненные в отчетном году, были посвящены селекции и изучению генетических механизмов формирования резистентности к антибиотикам, действующим на клеточную стенку (цефтаролину, ванкомицину и даптомицину), у ранее охарактеризованных изолятов метициллинрезистентных стафилококков (MRSA) и S. pneumoniae. Основным инструментом изучения механизмов формирования резистентности был анализ результатов полногеномного секвенирования исходных штаммов бактерий и их изогенных мутантов, полученных в результате селекции резистентности in vitro. Секвенирование проводили на платформе Miesq c получением 250 – 300 п.н. парнокоцевых ридов с использованием наборов Nextera XT. Секвенированные геномы имели среднее покрытие: х50 – 100, N50: 35 – 90 тыс.п.н., среднее количество контигов/скаффолдов при сборке De novo 55 – 120. Риды полногеномного запуска зарегистрированы в NCBI BioProject под номером PRJNA325350. Для анализа данных полногеномного секвенирования были отработаны биоинформатические алгоритмы, позволяющие достоверно выполнять поиск, аннотацию геномных изменений при сравнительном анализе. Наиболее интересные результаты были получены при селекции устойчивости MRSA к цефтаролину. Цефтаролин является одним из первых бета-лактамных антибиотиков, проявляющих активность в отношении MRSA за счет способности ингибировать пенициллинсвязывающий белок 2а (ПСБ2а, ген mecA), отличающийся низкой аффинностью к другим бета-лактамам. Несмотря на то, что антибиотик стал доступным в медицинской практике относительно недавно, в различных географических регионах, в том числе и в Российской Федерации появились изоляты MRSA, проявляющие к нему сниженную чувствительность. В этой связи прогнозирование вероятности дальнейшего распространения резистентности, расшифровка ее механизмов в целях поиска путей преодоления представляют особую актуальность. Методология селекции устойчивости к цефтаролину была основана на концепции «окна селекции мутантов» (mutant selection window - MSW). Под MSW понимают диапазон концентраций от минимальной подавляющей (МПК) до предотвращающей образование резистентных мутантов (mutant prevention concentration - MPC). Показано, что воздействие на бактериальные культуры этих концентраций антибиотиков связано с наибольшей вероятностью селекции мутаций. В настоящей работе показано, что «ширина» MSW для цефтаролина может сильно варьировать даже для изолятов сходного генотипа. У исходных штаммов MRSA МПК цефтаролина варьировала в пределах 0.5 – 2.0 мкг/мл, а после цикла селекции резистентности (40 пассажей) достигла 64 – 256 мкг/мл. В ходе сравнительного анализа геномов мутации в основных мишенях действия бета-лактамов (генах mecA и pbp2) были выявлены лишь у одного из пяти штаммов включенных в эксперимент. В тоже время у изогенных мутантов, устойчивых к цефтаролину, в генах ряда белков, не являющихся непосредственными мишенями действия бета-лактамов, были выявлены полиморфизмы, возможно участвующие в развитии резистентности. У изолятов SA0077, SA0085 и SA0422 в гене неэссенциальной трансмембранной фосфодиэстеразы (gdpP) были выявлены мутации (соответственно, Arg322Cys, Thr260Ala и Arg545X), которые по некоторым данным снижают или блокируют функциональную активность gdpP, (Corrigan RM et al 2011, Griffiths JM et al, 2012 и Dengler V et al, 2013). Блокада активности gdpP, в свою очередь, приводит к накоплению в клетке вторичных мессенджеров цикло-ди-аденозинмонофосфатов (c-di-AMP), действующих предположительно на стимулон клеточной стенки, однако как это влияет на устойчивость к цефтаролину не известно. Кроме указанных полиморфизмов, у устойчивых к цефтаролину штаммов были обнаружены и другие мутации: • В гене неэссенциального пенициллинсвязывающего белка PBP4, • В промоторной области гена acrB, кодирующего неспецифическую эффлюксную помпу, гиперэкспрессия которой предположительно, способствует активному выведению цефтаролина из клетки. • Делеция в гене O-acetyltransferase (OatA), который ответственен за устойчивость к лизоциму и широко представлен у клинических изолятов стафилококков. Продукт гена ацилирует участок пептидогликана, тем самым обуславливает устойчивость к ферменту. Потеря функции ацилирования при формировании устойчивости к цефтаролину остается не совсем понятной. • В гене tarH (Phe74Leu), кодирующего АТФ – связывающую субъединицу экспортного комплекса тейхоевых кислот (two-component ABC transporter). • В системе синтеза тейхоевых кислот. • В гене itaS, ответственном за синтез липотейхоевых кислот. Роль мутаций в генах биосинтеза тейхоевых кислот при формировании устойчивости к бета-лактамам остается не изученной. Эксперименты по определению MPC и селекции в области MSW для ванкомицина и даптомицина оказались неудачными, что, вероятно, было связано с плохой диффузией этих высокомолекулярных антибиотиков в агаризованной среде. В этой связи, селекцию устойчивости проводили в жидкой питательной среде. При селекции на ванкомицине удалось достичь увеличения МПК от 0.5 мкг/мл до 4 – 8 мкг/мл, то есть получить фенотипы VISA для всех изолятов, включенных в эксперимент. В геномах у мутантов был обнаружен ряд ключевых, ранее описанных мутации: в двух – компонентной системе, регулирующей процесс сборки клеточной стенки (ген vicK, мутация Y505H), а также в двух глобальных регуляторах клетки – rpoC (A947S) и kdpD (Gln261Asn). У изолята SA0736 также выявлена мутация в vicK (G223D) и rpoB (R406H). Варианты мутаций в позиции 406 субъединицы rpoB описываются у VISA изолятов, как среди клинических вариантов, так и полученных при селекции, при этом мутации возникающие в области 400 – 500 аминокислот часто являются «переключателями» фенотипов: VSSA – hVISA – VISA. Наконец, у штамма ATCC29213 выявлена мутация в глобальном регуляторе srrA (T80I), который регулирует работу факторов вирулентности, а также отвечает на оксидативный стресс. У изолятов SA0085, SA0422, ATCC29213 не выявлено характерных мутаций, ассоциированных со снижением чувствительности к ванкомицину. Формирование устойчивости к ванкомицину носит сложный ступенчатый характер, и на сегодняшний день нельзя выделить конкретно гены и группу генов, ответственных за формирование устойчивости. Задача выявления значимых мутаций существенно осложнилась феноменом гетерорезистентности, то есть неоднородности бактериальной популяции. Оказалось, что уровень гетеро-мутаций, то есть присутствие нескольких вариантов аллелей генов в секвенируемом прокариотическом геноме значительно выше по сравнению с данными полученными при селекции на других антибиотиках (цефтаролине, даптомицине). Так соотношение гомо-мутаций и гетеро-мутаций при анализе ридов составлял соответственно 1:3. По завершению селекции на даптомицине удалось получить увеличение МПК для всех изолятов, включая лабораторный референс – штамм ATCC29213 до 32 - 128 мкг/мл (изначальный уровень составлял <=1 мкг/мл). Сравнительный геномный анализ показал, что у мутантов были как хорошо описанные мутации (в генах mprF, clp1 и vicK), так и новые, ранее не описываемые. Так у изолята SA0736 и референс – штамма ATCC29213 не было обнаружено ранее описанных мутаций при устойчивости к даптомицину. Однако, обращает на себя внимание ген fabF, который участвует в липидном метаболизме микробной клетки. Так, фермент FabF катализирует реакции начального этапа формирования глицеролипидов и фосфоглицеролипидов, основных компонентов мембран. Роль в формировании рассматриваемого гена в устойчивости к даптомицину не известна, данный ген один из кандидатов на дальнейшее изучение в опытах по мутагенезу. Еще один потенциальный кандидат для дальнейшего изучения ген (orf) с неизвестной функцией SAV1869, так у изолятов SA0085 и SA0420 были обнаружены stop – кодоны в этой области, соответственно в позициях Trp265X и E206X. Анализ аминокислотного состава этого локуса in silico показал, что протеин имеет домены суперсемейства YdjM, этот мембранный протеин с гидролазной функцией, предположительно фосфолипаза, которая отвечает на SOS – сигналы клетки. Остается не понятным как выключение этого протеина через stop-кодоны может влиять на развитие устойчивости к даптомицину. Другие мутации в кодирующих областях, обнаруженные у мутантов затрагивают различные системы – адгезины, тейхоевые кислоты, гены генерального метаболизма. В ходе экспериментов по селекции устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам, действующим на клеточную стенку, получить мутантов с существенным повышением МПК не удалось. В этой связи для поиска полиморфизмов в генах, не являющихся непосредственными мишенями действия бета-лактамов были использованы результаты полногеномного секвенирования на платформах IonTorrent, LifeTechnologies (штамм PGM2), и MiSeq, Illumina изолятов, выделенных в ФГБУ «НИИ Детских инфекций ФМБА России» (штаммы 3733, 1950_231, 148_87 и 438_198); а также данные полногеномного секвенирования (короткие риды, HiSeq, Illumina) 41 штамма S. pneumoniae, относящихся к клональной группе CC320, полученные из базы данных European Nucleotide Archive (ENA). Результаты серотипирования и оценки антибиотикочувствительности этих изолятов были получены из публикаций (Chewapreecha C, et al., 2014 и Croucher NJюб уе фдюб 2013). Геном референсного штамма S. pneumoniae TW31 (Taiwan19F-14/PMEN14, Пневмококковая молекулярная эпидемиологическая сеть; ATCC700905, Американская коллекция типовых культур) получен из базы данных GenBank (NC_012469.1). Установлено, что снижение чувствительности к бета-лактамам связано не только с мутациями в генах синтеза пептидогликана и клеточного деления, но и с изменениями в генах метаболизма нуклеиновых кислот и углеводного обмена. Наиболее очевидным и изученным механизмом формирования устойчивости является формирование мозаичных генов пенициллинсвязывающих белков ПСБ2Х и ПСБ2В. Кроме известных мутация были обнаружены изменения в коротком N-концевом цитоплазматическом домене белка клеточного деления FtsL, регулирующего поперечный рост клетки и участвующего в формировании комплекса белков клеточного деления. Мутации также были обнаружены в генах ряда других белков, участвующих в клеточном делении GpsB, EngB MapZ RecU. . У всех резистентных к пенициллину штаммов S. pneumoniae мы обнаружили мутацию I235V в C-концевом домене гипотетической N6-аденин-специфичной метилазы ДНК. У резистентных штаммов обнаружено две аминокислотные замены в C-терминальной области белков суперсемейства MutT/Nudix, гидролизующих нуклеозид дифосфат (E124Q; D125N). Cравниваемые аминокислотные последовательности гепариназа-II/III-подобного белка отличались у всех резистентных штаммов наличием трех замен в области N-терминального домена. Ген, кодирующий гепариназа-II/III подобный белок является частью RegR-регулона, который включает три граничащих друг с другом транскрипционные единицы. Белок RegR относится к регуляторам транскрипции семейства LacI/GalR, характеризующимся наличием мотива спираль-петля-спираль в N-концевом домене, вовлеченном в связывание этим белком ДНК, а также мотива в C-концевом домене, связывающего белки и углеводы и выполняющего регуляторные функции. У всех резистентных к пенициллину изолятов S.pneumoniae, принадлежащих ST236, ST271, мутации в последовательностях белка RegR были локализованы в С-концевом домене. В целом анализ геномов изолятов грамположительных бактерий со сниженной чувствительностью к антибиотикам, действующим на клеточную стенку, выявил ряд полиморфизмов, вероятно, связанных с формированием устойчивости. Для верификации их роли в развитии резистентности необходимы дополнительные исследования.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В настоящей работе, при селекции Staphylococcus aureus на протяжении 40 пассажей, мы получили стабильное повышение МПК к антибиотикам трех классов, действующих на клеточную стенку. В работе было установлено, что для большинства штаммов, включенных в исследование не характерно наличие спонтанных мутаций, появляющихся при первом воздействии антибиотика. Так, практически все значимые мутации формируются после 20 – 40 пересевов за исключением мутантов, полученных при селекции на цефтаролине. Была проведена сравнительная оценка биологической цены сопротивления (fitness cost) для мутантов, полученных в ходе селекции резистентности. Селекция к каждому из антибиотиков сопровождалась изменением в скорости роста. Для мутантов после селекции характерно увеличение времени удвоения клеток в среднем на 10 минут, пролонгации lag – фазы на 1,5 - 2 часа и снижение скорости накопления биомассы на 30%. Интересным наблюдением стало то, что мутанты, полученные на цефтаролине характеризовались ступенчатым накоплением мутаций. Так, изначально (5 пересев) появились изменения в промоторной области pbp4, что скорее всего связано с высокой его экспрессией. На последующих этапах (20 – 40 пересевы) происходило образование мутаций уже в самом гене pbp4 а также gdpP, гене ответственным за разрушение вторичных мессенджеров c-di-AMP. Таким образом, включение механизма резистентности через внутриклеточное накопление сигнальных молекул c-di-AMP происходит на последних стадиях селекции с преодолением воздействия высоких концентраций антибиотика. Цефтаролин – устойчивые мутанты характеризовались наименьшим fitness cost, по сравнению с ванкомицин и даптомицин - устойчивыми штаммами. В среднем, скорость роста у мутантов уменьшилась на 15%, время клеточного деления увеличилось на 6 минут, и lag – фаза удлинилась на 32% (что соответствует увеличению в среднем на 1 час 20 минут). Мутант, у которого (штамм SA0146/40) выявлены мутации в транспептидазном домене mecA гена, отличался наименьшими изменениями в скорости роста. В целом механизмы устойчивости, связанные с мутациями в pbp4 и его промоторе, а также мутации в gdpP связаны с более выраженным fitness cost. По результатам сравнительно - протеомных исследований нами была выявлена гиперэкспрессия бета – лактамазы (blaZ) при воздействии меропенема у мутанта SA0077/40, устойчивого к цефтаролину. Цефтаролин и другие бета-лактамные антибиотики не обладают субстратной специфичностью для стафилококковой бета – лактамазы, и такое явление требует более детального изучения. Селекция на ванкомицине сопровождалась формированием мутаций в регуляторных генах, как глобальных, так и входящих в CW – регулон. Эти мутации появлялись на 20 – 40 пассажи. Опыты по time – killing показали, что количество мутантов (VISA), при воздействии терапевтических концентраций (15 и 50 мкг/мл) ванкомицина, снижается только 1 – 2 логарифма с возобновлением роста уже через 24 часа (re-growth). VISA – штаммы, характеризовались в среднем снижением скорости роста на 30%, увеличением времени удвоения клеток на 37% (с 23 минут до 33 минут) и увеличением lag – фазы до 3 часов (у диких штаммов – 2 часа). Наиболее значительные изменения в характере роста были выявлены у мутантов, устойчивых к даптомицину. Так, скорость роста была снижена на 35%, время удвоения увеличилось до 34 мин и lag – фаза была продлена до 4,6 часов. Даптомицин – препарат с уникальным механизмом действия, который дестабилизирует цитоплазматическую мембрану (ЦПМ). Цитоплазматическая мембрана является важнейшим компонентом микробной клетки и механизмы связанные с устойчивостью к даптомицину затрагивают метаболические пути, связанные с биосинтезом мембранных фосфолипидов. В мире описываются редкие случаи устойчивости стафилококков к даптомицину, по всей видимости, это связано с высоким fitness cost, что подтверждается данными полученными в настоящем исследовании. У некоторых мутантов, устойчивых к даптомицину формирование мутаций происходило уже к 5 пересеву. Было отмечено, все мутанты характеризовались наличием миссенс – мутаций в гене mprF. Дополнительно, уже к 40 –му пересеву (МПК даптомицина составляла 64 мкг/мл и более) были обнаружены мутации в кардиолипин синтазе (clp1), продукт этого гена принимает участие в биосинтезе фосфолипидов и интенсивно синтезируется в стационарной фазе роста оказывает мощное протективное действие при сильных стрессорных воздействиях. По результатам популяционного анализа (PAP) было установлено, что селекция на ванкомицине или даптомицине способствуют снижению чувствительности к обоим антибиотикам. За время селекции удалось также получить мутантов methicillin – susceptible S.aureus (MSSA), проявляющих устойчивость к оксациллину и цефтаролину. Так, удалось добиться повышения МПК цефтаролина с 0,125 мкг/мл до >32 мкг/мл. Полученные мутанты являются важным биологическим объектом для дальнейшего изучения, поскольку используются как контроль сравнения геномных изменений у золотистого стафилококка при формировании устойчивости к цефтаролину.